El Virrey Francisco Toledo, durante su visita a Arequipa, fue informado por el Cabildo, sobre su deseo de años atrás, de fundar un monasterio de monjas. Ello lo motivó a otorgar las licencias necesarias para la fundación del "Monasterio de Monjas Privado de la Orden de Santa Catalina de Siena".
Años más tarde, Doña María de Guzmán, viuda de Diego Hernández de Mendoza, mujer hermosa, rica y joven que no tuvo hijos, decide recluirse en el monasterio en construcción, cediendo para ello todos sus bienes. El 10 de setiembre de 1579 se hace la Memoria y Capitulación de la fundación del Monasterio firmada entre el Cabildo, Justicia y Regimiento de la Ciudad y el Obispado del Cusco, entregando el Cabildo los cuatro solares propiedad de la ciudad, para su funcionamiento; nombrando a Doña María de Guzmán "primera pobladora y priora de dicho Monasterio".

El domingo 2 de octubre de 1580, se celebra una misa mayor en la ciudad y Doña María, reconocida como fundadora, toma formalmente los hábitos.

Las mujeres que ingresaron como monjas al Monasterio fueron criollas, mestizas y hasta hijas de curacas. Recién en 1964 ingresaron las primeras monjas españolas. La historia también cuenta del ingreso de "monjas pobres" y damas de la ciudad, que sin abrazar la vida religiosa, ingresaban al Monasterio para ejercitar sus virtudes.

En 1582, Arequipa soportó un fuerte terremoto, sufriendo la construcción del Monasterio graves daños. A pesar de ello se conservó la clausura. A partir de entonces, se inicia un período de sufrimiento, en el cual las propias religiosas repararon sus habitaciones. La capilla, por falta de dinero, no se pudo refaccionar " por lo cual el Santísimo Sacramento se exponía en una choza de paja".